# 使用BRAKER2进行基因组注释 BRAKER2是一个基因组注释流程，能够组合GeneMark，AUGUSTUS和转录组数据。 在使用软件之前，有几点需要注意下 - 尽量提供高质量的基因组。目前随着三代测序价格下降，这一点问题不大。 - 基因组命名应该简单，最好就是">contig1"或">tig000001" - 基因组需要屏蔽重复序列 - 默认参数通常表现效果就很好，但是也要根据物种来 - 一定要对注释结果进行检查，别直接使用 ## 软件安装 BRAKER的依赖软件不少，且Perl需要安装的模块也很多，但是我们可以直接用bioconda进行安装 ```bash conda create -n braker2 braker2 ``` 使用conda安装结束后会有一些提示语，总结如下 - 保证AUGUSTUS的config目录能够有可写权限（自己用conda安装不需要考虑这个问题） - GeneMark/GenomeThreader/ProtHint需要额外下载安装 > 尽管可以使用容器化技术，但是由于软件运行时需要对AUGUSTUS里的配置文件进行读写，需要额外设置，因此不在此介绍 由于部分软件的版权限制，也就是GeneMakr, GenomeThreader, ProHint，我们还需要手动安装这些软件。但其中只有GeneMark是必须的，因为我们更多是利用RNA-seq数据进行模型训练，而GenomeThreader, ProHint是利用同源蛋白进行注释才用到，其中GenomeTrheads是处理近源蛋白，而ProHint是处理未知距离的蛋白。 从 <http://exon.gatech.edu/GeneMark/license_download.cgi> 下载GeneMark，并按照文档进行安装，最后添加环境变量 ```bash export GENEMARK_PATH=/your_path_to_GeneMark-ET/gmes_petap/ #例如,我的安装路径为/opt/biosoft/gm_et_linux_64 export GENEMARK_PATH=/opt/biosoft/gm_et_linux_64 ``` 安装完成之后，建议运行下面这一步检查软件依赖 ```bash braker.pl --checkSoftware ``` ## 软件运行 BRAKER根据数据类型，有[不同的运行模式](https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER#overview-of-modes-for-running-braker)，但根据现状其实最常见的情况是测了一个基因组，并且还测了二代的转录组。因此假设你手头有下面这些数据 - 基因组序列: genome.fasta - 转录组数据: XX_R1.fq.gz, XX_R2.fq.gz, YY_R1.fq.gz, YY_R2.fq.gz, ZZ_R1.fq.gz, ZZ_R2.fq.gz 第一步: 屏蔽基因组中的重复序列，这一步参考[使用RepeatModeler和RepeatMasker注释基因组重复序列](/archives/Annotate-repeat-in-genome-with-RepeatModeler-and-RepeatMasker) ```bash RepeatMasker -xsmall -species arabidopsis -pa 40 -e ncbi -dir . genome.fasta #-xsmall: soft-mask ``` 这一步输出的genome.fasta.masked将是后续注释的输入 第二步: 使用STAR将FastQ比对到参考基因组，STAR使用说明参考[「RNA-seq分析软件」RNA-seq比对工具STAR学习笔记](/archives/RNA-seq-aligner-STAR) ```bash mkdir -p STAR # 建立索引 STAR \ --runThreadN 20 \ --runMode genomeGenerate \ --genomeDir STAR \ --genomeFastaFiles genome.fasta # 比对 STAR \ --genomeDir STAR \ --runThreadN 20 \ --readFilesIn XX_R1.fq.gz, XX_R2.fq.gz \ --readFilesCommand zcat \ --outFileNamePrefix xx_ \ --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ --outBAMsortingThreadN 10 \ --outSAMstrandField intronMotif \ --outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical mv xx_Aligned.sortedByCoord.out.bam xx.bam ``` 输入结果为 xx.bam 如果测了多个组装的转录组，为每个样本运行一次比对生成多个BAM文件。 第三步: 运行BRAKER2。`--cores 40`表示使用40个线程, `--softmaksing`表示输入序列是软屏蔽。 ```bash braker.pl --cores 40 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \ --softmasking --bam=xx.bam,yy.bam,zz.bam \ --gff3 ``` 这里xx.bam, yy.bam,zz.bam指的是不同组织的BAM文件，需要根据实际情况进行修改。 对于链特异性转录组测序结果，需要将BAM文件拆分成正链和负链两个bam，然后设置`--stranded`参数。 ```bash braker.pl --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \ --softmasking --bam=plus.bam,minus.bam,unstranded.bam \ --stranded=+,-,. --UTR=on ``` 如果需要使用近源序列作为输入(protein.fa)，需要加上`--prot_seq`和`--prg`参数，速度会慢一些 ```bash braker.pl --cores 40 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \ --softmasking --bam=xx.bam,yy.bam,zz.bam \ --gff3 \ --prot_seq=proteins.fa --prg=exonerate \ ``` > 个人感觉，只要转录组测得够，不需要考虑同源蛋白数据。 最终会输出蛋白序列和CDS序列以及GFF文件 - augustus.hints.gtf: 在`--esmode`时不会出现 - augustus.hints_utr.gtf: 在设置`--UTR=on `时生成 - augustus.ab_initio.gtf: 在设置`--AUGUSTUS_ab_initio`生成 - augustus.ab_initio_utr.gtf: 在从头预测的基础上设置`--UTR=pn`时生成 - GeneMark-E*/genemark.gtf: GeneMark的注释结果 - braker.gtf: AUGUSTUS或GeneMark预测的所有结果 - hintsfile.gff: 来自于RNA-seq/蛋白数据的外部证据信息 此外，如果没有设置`--skipGetAnnoFromFasta`, 还会有`augustus.hints.aa`和`augustus.hints.codingseq` **注意**: BRAKER没有断点重跑功能，因此如果中途运行中断，重新运行之前的命令并不会断点重跑，反而会因为同样的参数和之前运行在AUGUSTUS的config/species生成的目录冲突而中断。另外设置`--useexisting`只是覆盖之前`config/species`对应的目录，而不是利用已有的文件重新开始 尽管如此，我们还是能够在BRAKER中通过跳过一些步骤来避免一些重复运算 - `--skipGeneMark-ES/--skipGeneMark-ET/--skipGeneMark-EP/--skipGeneMark-ETP`: 跳过GeneMark训练这一步，使用之前的结果`braker/GeneMark-ET/genemark.gtf`，或者使用`--geneMarkGtf`设置GTF文件 - `--skipAllTraining`: 跳过GeneMark和AUGUSTUS的模型训练，使用之前的参数和文件(`--useexisting`)运行AUGUSTUS 官方教程也提供了一些案例，见<https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER#starting-braker-on-the-basis-of-previously-existing-braker-runs> 除此之外，如果想要提高速度，还可以设置如下参数 - `--skipOptimize`: 跳过参数优化步骤（不推荐） - `--rounds`: 参数优化迭代数，默认是5，追求速度可以设置的低一些 ## 可能问题 运行时出现和OpenBLAS相关的警告和报错 ```bash OpenBLAS blas_thread_init: RLIMIT_NPROC 4096 OpenBLAS blas_thread_init: pthread_create failed for thread 26 of 128: Resource temporarily unavailable ``` 需要在运行前设置如下两个环境变量 ```bash export OMP_NUM_THREADS=1 #限制CPU数 export USE_SIMPLE_THREADED_LEVEL3=1 ``` 使用conda安装时可能会出现的问题 ```bash Error in file bamToWig.py at line 172: Return code of subprocess was 127 ``` 原因是因为`faToTwoBit`程序出错 ```bash faToTwoBit faToTwoBit: error while loading shared libraries: libssl.so.1.0.0: cannot open shared object file: No such file or directory ``` 这是因为conda没能正确处理依赖关系，openssl版本过高，解决方法如下 ```bash # 建立软链接 cd ~/miniconda3/envs/braker2/lib ln -s libssl.so libssl.so.1.0.0 ln -s libcrypto.so libcrypto.so.1.0.0 ``` ## 参考资料 - BRAKER2官方教程: https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER