# 第11章: 使用ArchR鉴定标记Peak
在讨论基因得分(gene score)这一章中，我们已经介绍了标记特征的鉴定。相同的函数`getMakerFeatures()`也能够用于从`ArchRProject`任意矩阵中鉴定标记特征。所谓的标记特征指的是相对于其他细胞分组唯一的特征。这些特征能帮助我们理解类群或者细胞类型特异的生物学现象。在这一章中，我们会讨论如何使用该功能鉴定标记peak。
## 11.1: 使用ArchR鉴定标记Peak
通常而言，我们想知道哪些peak是某个聚类或者某一些聚类所特有的。在ArchR中，这可以通过设置`addMarkFeatures()`函数的`useMatrix="PeakMatrix"`来实现（无需监督）。
首先，我们需要再看一眼`projHeme5`中有哪些细胞类型，以及它们的相对比例
```r
table(projHeme5$Cluster2)
```
现在，让我们调用`getMarkerFeatures`参数，并设置`useMatrix="PeakMatrix"`. 此外，为了降低不同细胞组之间的数据质量对结果的影响，我们可以设置`bias`参数，其中`bias = c("TSSEnrichment", "log10(nFrags)")`就是用来避免TSS富集和每个细胞的fragment数对结果的影响。
```r
markersPeaks <- getMarkerFeatures(
ArchRProj = projHeme5,
useMatrix = "PeakMatrix",
groupBy = "Clusters2",
bias = c("TSSEnrichment", "log10(nFrags)"),
testMethod = "wilcoxon"
)
```
`getMarkerFeatures()`函数返回一个`SummarizedExperiment`对象，该对象包含一些不同的`assays`
```r
markerPeaks
```
接着，我们可以用`getMarkers`函数从输出的`SummarizedExperiment`对象中提取我们感兴趣的部分。默认情况下，它会返回一个包含多个`DataFrame`的列表，不同的`DataFrame`表示来自不同的细胞分组。
```r
markerList <- getMarkers(markersPeaks, cutOff = "FDR <= 0.01 & Log2FC >= 1")
markerList
```
如果我们对特定的一个细胞分组感兴趣，我们可以用`$`进行提取。
```r
markerList$Erythroid
```
除了返回一个包含多个`DataFrame`的列表外，我们还可以用`getMarkers()`返回一个`GRangesList`，只要设置`returnGR=TRUE`即可。
```r
markerList <- getMarkers(markersPeaks, cutOff = "FDR <= 0.01 & Log2FC >= 1", returnGR = TRUE)
markerList
```
这个`GRangesList`同样可以用`$`提取特定细胞组的结果，返回的是一个`GRanges`对象
```r
markerList$Erythroid
```
## 11.2 在ArchR中绘制Marker Peaks
ArchR提供了许多绘图函数用于`getMarkerfeatuers()`返回的`SummarizedExperiment`对象的可视化。
### 11.2.1 Marker Peak Heatmap
`markerHeatmap`能以热图的形式展示标记Marker Peak（或者其他`getMarkerFeatures()`输出的特征）
```r
heatmapPeaks <- markerHeatmap(
seMarker = markersPeaks,
cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 0.5",
transpose = TRUE
)
```
使用`draw`函数绘制结果
```r
plotPDF(heatmapPeaks, name = "Peak-Marker-Heatmap", width = 8, height = 6, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)
```
`plotFDF()`函数能够以可编辑的矢量版本保存图片
```r
plotPDF(heatmapPeaks, name = "Peak-Marker-Heatmap", width = 8, height = 6, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)
```
### 11.2.2 Marker Peak MA和火山图
除了绘制热图，我们也可以为每个细胞分组绘制MA或者火山图(volcano)。这些图可以用`markerPlot()`函数绘制。对于MA图，需要设置参数`plotAs="MA"`. 我们以"Erythroid"细胞分组为例，设置参数`name = "Erythroid"`
```r
pma <- markerPlot(seMarker = markersPeaks, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 1", plotAs = "MA")
pma
```
同样的，只要设置`plotAs="Volcano"`就可以绘制火山图
```r
pv <- markerPlot(seMarker = markersPeaks, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 1", plotAs = "Volcano")
pv
```
`plotFDF()`函数能够以可编辑的矢量版本保存图片。
```r
plotPDF(pma, pv, name = "Erythroid-Markers-MA-Volcano", width = 5, height = 5, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)
```
### 11.2.3 Browser Tracks的Marker Peak
此外，我们在基因组浏览器上检查这些peak区域，只需要为`plotBrowserTrack()`函数的`features`参数传入 相应的peak区间。这会额外在我们的ArchR track图的下方以BED形式展示marker peak区域。
```r
p <- plotBrowserTrack(
ArchRProj = projHeme5,
groupBy = "Clusters2",
geneSymbol = c("GATA1"),
features = getMarkers(markersPeaks, cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 1", returnGR = TRUE)["Erythroid"],
upstream = 50000,
downstream = 50000
)
```
我们使用`grid::grid.draw()`绘制结果
```r
grid::grid.newpage()
grid::grid.draw(p$GATA1)
```
`plotFDF()`函数能够以可编辑的矢量版本保存图片。
```r
plotPDF(p, name = "Plot-Tracks-With-Features", width = 5, height = 5, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)
```
## 11.3 组间配对检验
标记特征鉴定是一种特别的差异表达检验。此外，使用相同的`getMarkerFeatures()`函数也能实现标准化的差异分析。我们只需要设置`useGroup`为一组细胞，然后设置`bgdGroup`为另一组细胞即可。这就可以对给定两组进行差异分析。在这些差异分析中，在`useGroups`比较高的peak的倍数变化值是正数，在`bgdGroups`比较高的peak则是由负的倍数变化值。
这里，我们对"Erythroid"与"Progenitor"细胞组进行配对检验。
```r
markerTest <- getMarkerFeatures(
ArchRProj = projHeme5,
useMatrix = "PeakMatrix",
groupBy = "Clusters2",
testMethod = "wilcoxon",
bias = c("TSSEnrichment", "log10(nFrags)"),
useGroups = "Erythroid",
bgdGroups = "Progenitor"
)
```
使用`markerPlot()`函数可以绘制MA或者火山图。MA图需要设置`plotAs="MA"`
```r
pma <- markerPlot(seMarker = markerTest, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & abs(Log2FC) >= 1", plotAs = "MA")
pma
```
火山图需要设置`plotAs="Volcano"`
```r
pv <- markerPlot(seMarker = markerTest, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & abs(Log2FC) >= 1", plotAs = "Volcano")
pv
```
`plotFDF()`函数能够以可编辑的矢量版本保存图片。
```r
plotPDF(pma, pv, name = "Erythroid-vs-Progenitor-Markers-MA-Volcano", width = 5, height = 5, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)
```
在后续章节中，我们还会进行差异分析，因为会在我们的差异开放的peak中搜索富集的motif。
使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第十一章)
