## 软件安装 软件的GitHub地址为<https://github.com/alexdobin/STAR>, 下载页面为<https://github.com/alexdobin/STAR/releases>, 挑最新的下载，避免bug。 ## 软件使用 `STAR`的主程序只有两个:`STAR`和`STARlong`。前者用于比对RNA-seq数据，后者是针对于长读长RNA数据。由于同一个程序，又需要做建索引，又需要做序列比对，并且这个程序还支持一系列的输出格式，因此直接用STAR，你会迷失在参数的海洋中。所以我们需要先阅读[文档](https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf) ，先对整体有一个了了解。 STAR的基本使用流程分为两步： 1. 生成基因组索引文件。你需要提供基因组序列(FASTA)和注释文件(GTF) 2. 将读段回帖到基因组。这一步需要提供的是RNA-seq数据，格式目前都是FASTQ/FASTA, 最后会得到很多很多的文件，常规的SAM/BAM文件，可变剪切点文件，未回帖上的读段和常用于展示信号的WIG文件。 STAR的使用格式为 ```bash STAR --option1-name option1-value --option2-name option2-value ... ``` ### 建立索引 举例说明: ```bash STAR --runMode genomeGenerate \ --genomeDir ref \ --runThreadN 20 \ --genomeFastaFiles reference.fa\ --sjdbGTFfile reference.gtf ``` 常用参数说明 * --runThreadN 线程数 :设置线程数 * --runMode genomeGenerate : 设置模式为构建索引 * --genomedDir 索引文件存放路径 : 必须先创建文件夹 * --genomeFastaFiles 基因组fasta文件路径 : 支持多文件路径 * --sjdbGTFfile gtf文件路径 : 可选项，高度推荐,用于提高比对精确性 * --sjdbOverhang 读段长度: 后续回帖读段的长度, 如果读长是PE 100， 则该值设为100-1=99 几个额外要说明的点： * 由于物种的组装的复杂性，存在一些为组装上的片段，这些片段不需要放在参考序列中，尤其是可变单倍型(alternative haplotypes) * 如果基因组的contig过多，超过5000，你需要用 `--genomeChrBinNbits=min(18,log2[max(GenomeLength/NumberOfReferences,ReadLength)])` 降低RAM消耗 * 选择最新的注释文件，人类和小鼠常在<http://www.gencodegenes.org>下载，植物的可信基因组见<http://plants.ensembl.org> * 如果没有设置`--sjdbGTFfile`或`--sjdbFileChrStartEnd`，就不需要设置`--sjdbOverhang` ### 读段回帖 用法举例 ```bash STAR \ --genomeDir ref \ --runThreadN 20 \ --readFilesIn sample_r1.fq.gz sample_r2.fq.gz \ --readFilesCommand zcat \ --outFileNamePrefix sample \ --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ --outBAMsortingThreadN 10 ``` 参数说明 * --runThreadN 设置线程数 * --runMode alignReads : 默认就是比对模式，可以不填写 * --genomeDir: 索引文件夹 * --readFilesIn FASTA/Q文件路径 * --readFilesCommand zcat: 如果输入格式是gz结尾，那么需要加上zcat, 否则会报错 * --outSAMtype: 输出SAM文件的格式，是否排序 * --outBAMsortingThreadN: SAM排序成BAM时调用线程数 默认参数下，会输出文件在当前文件夹， ```bash Aligned.out.sam Log.final.out Log.out Log.progress.out SJ.out.tab ``` 可以用`--outFileNamePrefix`指定文件夹和前缀，其中"Aligned.out.sam"是默认回帖后输出。一般而言，SAM文件过大，不方便后续使用，我们更需要的是BAM文件。最好是类似于`samtools sort`的输出文件，那么设置参数为`--outSAMtype BAM SortedByCoordinate`。 如果你设置的线程数非常大，那么你很有可能会遇到如下这种报错，我的解决方案就是降低线程数。 ```bash FATAL ERROR: number of bytes expected from the BAM bin does not agree with the actual size on disk ``` xxx.out文件是一些日志信息. "SJ.out.tab"存放的高可信的剪切位点，每一列的含义如下 * 第一列: 染色体 * 第二列: 内含子起始（以1为基） * 第三列: 内含子结束（以1为基） * 第四列：所在链，1(+)，2(-) * 第五列: 内含子类型，0表示不是下面的任何一种功能，1表示GT/AG, 2表示:GT/AC,3表示GC/AG,4表示GT/GC,5表示AT/GC,6表示GT/AT * 第六列: 是否是已知的注释 * 第七列: 有多少唯一联配支持 * 第八列: 有多少多重联配支持 * 第九列: maximum spliced alignment overhang, 这个比较难以翻译，指的是当短读比对到剪切位点时，中间会被分开，另一边能和基因组匹配的数目，例如ACGTACGT----------ACGT，就是4或者8，取决于方向。 控制过滤的参数为`--outSJfilter*`系列，其中`--outSJfilterCountUniqueMin 3 1 1 1`表示4类内含子唯一匹配的read支持数至少为3,1,1,1, 而`--outSJfilterCountTotalMin 3 1 1 1`则表示4类内含子唯一匹配和多重匹配read的支持数和，至少为3,1,1,1。如果你设置的`--outSJfilterReads Unique`，那么上面两者是等价的，当然默认情况下是`All` **注意**：双端测序中一定要注意不能把文件输入错了，不然比对率几乎为0。下面我一次脚本翻车记录，两个都是R1和R1，应该是R1和R2  ### 更多参数 除了上面常用的一些参数外，STAR的可选参数其实非常多. 输出BAM文件时，STAR还可以对BAM进行一些预处理，"--bamRemoveDuplicatesType"用于去重("UniqueIdentical","UniqueIdenticalNotMulti") 如果你希望输出信号文件(Wig格式),那么需要额外增加`--outWigType`参数，如`--outWigType wiggle read2`, 还可以用`--outWigStrand`指定是否将两条链合并(Stranded, Unstranded), 默认`--outWigNorm RPM`，也就是用RPM进行标准化，可以选择None. 如果你在建立索引或者比对的时候增加了注释信息，那么STAR还能帮你进行基因计数。参数为`--quantMode`, 分为转录本水平(TranscriptomeSAM)和基因水平(GeneCounts)，在计数的时候还允许指定哪些哪些read不参与计数，"IndelSoftclipSingleend"和"Singleend" 对于非链特异性RNA-seq，同时为了保证能和**Cufflinks**兼容，需要添加`--outSAMstrandField intronMotif`在SAM中增加XS属性，并且建议加上`--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical`。如果是链特异性数据，那么就不需要特别的参数，Cufflinks用`--library-type`声明类型即可=