谈论到直系同源基因分析的时候，大部分教程都是介绍OrthoMCL，这是2003年发表的一个工具，目前的引用次数已经达到了3000多，但这个软件似乎在2013年之后就不在更新，而且安装时还需要用到MySQL（GitHub上有人尝试从MySQL转到sqlite）。
而OrthoFinder则是2015年出现的软件，目前已有400多引用。该软件持续更新，安装更加友好，因此我决定使用它来做直系同源基因的相关分析。
## OrthoFinder能做什么？
**OrthoFinder: solving fundamental biases in whole genome comparisons dramatically improves orthogroup inference accuracy**提到，它的优点就是比其他的直系同源基因组的推断软件准确，并且速度还快。
此外他还能分析所提供物种的系统发育树，将基因树中的基因重复事件映射到物种树的分支上，还提供了一些比较基因组学中的统计结果。
## OrthoFinder的分析过程
OrthoFinder的分析过程分为如下几步:
1. BLAST all-vs-all搜索。使用BLASTP以evalue=10e-3进行搜索，寻找潜在的同源基因。(除了BLAST, 还可以选择DIAMOND和MMSeq2)
1. 基于基因长度和系统发育距离对BLAST bit得分进行标准化。
1. 使用RBNHs确定同源组序列性相似度的阈值
1. 构建直系同源组图(orthogroup graph)，用作MCL的输入
1. 使用MCL对基因进行聚类，划分直系同源组
OrthoFinder2在OrthoFinder的基础上增加了物种系统发育树的构建，流程如下
1. 为每个直系同源组构建基因系统发育树
1. 使用STAG算法从无根基因树上构建无根物种树
1. 使用STRIDE算法构建有根物种树
1. 有根物种树进一步辅助构建有根基因树
基于Duplication-Loss-Coalescent 模型，有根基因树可以用来推断物种形成和基因复制事件，最后记录在统计信息中。
## 软件使用
在解压缩的OrthoFinder文件目录下(安装见最后)有一个 `ExampleData`, 里面就是用于测试的数据集。
```bash
orthofinder -f ExampleData -S mmseqs
# -f 指定文件夹
# -S 指定序列搜索程序，有blast, mmseqs, blast_gz, diamond可用
```
OrthoFinder的基本使用就是如此简单，而且最终效果也基本符合需求。
如果你想根据多序列联配(MSA)结果按照极大似然法构建系统发育树，那么你需要加上`-M msa`。这样结果会更加准确，但是代价就是运行时间会更久，这是因为`OrthoFinder`要做10,000 - 20,000个基因树的推断。
OrthoFinder默认用mafft进行多序列联配，用fasttree进行进化树推断。多序列联配软件还支持muscle, 进化树推断软件还支持iqtree, raxml-ng, raxml。例如参数可以设置为`-M msa -A mafft -T raxml`.
并行化参数: `-t`参数指定序列搜索时的线程数，`-a`指的是序列搜索后分析的CPU数。
## 软件细节
OrthoFinder提供了`config.json`可以调整不同软件的参数，如下是BLASTP。
OrthoFinder默认使用`DendroBLAST`发育树，也就是根据序列相似度推断进化关系。这是作者推荐的方法，在损失部分准确性的前提下提高了运算效率。当然你可以用`-M msa`从多序列比对的基础上进行基因树构建。如果你先用了默认的`DendroBLAST`，想测试下传统的MSA方法，那么也不需要重头运行，因为有一个`-b`参数可以在复用之前的比对结果。
在物种发育树的推断上，OrthoFinder使用STAG算法，利用所有进行构建系统发育树，而非单拷贝基因。此外当使用MSA方法进行系统发育树推断时，OrthoFinder为了保证有足够多的基因(大于100)用于分析，除了使用单拷贝基因外，还会挑选大部分是单拷贝基因的直系同源组。这些直系同源组的基因前后相连，用空缺字符表示缺失的基因，如果某一列存在多余50%的空缺字符，那么该列被剔除。最后基于用户指定的建树软件进行系统发育树构建。结果在"WorkingDirectory/SpeciesTree_unrooted.txt"
使用STRIDE算法从无根树中推断出有根树, 结果就是"SpeciesTree_rooted.txt".
## 结果文件
运行结束后，会在`ExampleData`里多出一个文件夹，`Results_Feb14`, 其中Feb14是我运行的日期
直系同源组相关结果文件，将不同的直系同源基因进行分组
- Orthogroups.csv：用制表符分隔的文件，每一行是直系同源基因组对应的基因。
- Orthogroups.txt: 类似于Orthogroups.csv，只不过是OrhtoMCL的输出格式
- Orthogroups_UnassignedGenes.csv: 格式同Orthogroups.csv，只不过是物种特异性的基因
- Orthogroups.GeneCount.csv：格式同Orthogroups.csv, 只不过不再是基因名信息，而是以基因数。
直系同源相关文件，分析每个直系同源基因组里的直系同源基因之间关系，结果会在`Orthologues_Feb14`文件夹下，其中`Feb14`是日期
- Gene_Trees: 每个直系同源基因基因组里的基因树
- Recon_Gene_Trees：使用OrthoFinder duplication-loss coalescent 模型进行发育树推断
- Potential_Rooted_Species_Trees: 可能的有根物种树
- SpeciesTree_rooted.txt: 从所有包含STAG支持的直系同源组推断的STAG物种树
- SpeciesTree_rooted_node_labels.txt: 同上，只不过多了一个标签信息，用于解释基因重复数据。
比较基因组学的相关结果文件：
- Orthogroups_SpeciesOverlaps.csv： 不同物种间的同源基因的交集
- SingleCopyOrthogroups.txt： 单基因拷贝组的编号
- Statistics_Overall.csv：总体统计信息
- Statistics_PerSpecies.csv：分物种统计信息
> STAG是一种从所有基因推测物种树的算法，不同于使用单拷贝的直系同源基因进行进化树构建。
## 一些重要概念:
- Species-specific orthogroup: 一个仅来源于一个物种的直系同源组
- Single-copy orthogroup: 在直系同源组中，每个物种里面只有一个基因。我们会用单拷贝直系同源组里的基因推断物种树以及其他数据分析。
- Unassigned gene: 无法和其他基因进行聚类的基因。
- G50和O50，指的是当你直系同源组按照基因数从大到小进行排列，然后累加，当加入某个组后，累计基因数大于50%的总基因数，那么所需要的直系同源组的数目就是O50，该组的基因树就是G50.
Orthogroups, Orthologs 和 Paralogs 这三个概念推荐看图理解。
## 如何安装？
### 最快的方法
OrthoFinder可以通过conda安装，建议为它新建一个虚拟环境
```bash
conda create -n orthofinder orthofinder=2.2.7
```
### 如果你愿意折腾
你先得安装它的三个依赖工具: MCL, FastME, DIAMOND/MMseqs2/BLAST+
MCL有两种安装方式，最简单的就是用`sudo apt-get install mcl`, 但是对于大部分人可能没有root权限，因此这里用源代码编译。<http://micans.org/mcl/>
```bash
wget https://www.micans.org/mcl/src/mcl-latest.tar.gz
tar xf mcl-latest.tar.gz
cd mcl-14.137
./configure --prefix=~/opt/biosoft/mcl-14.137
make -j 20 && make install
```
之后是MMseqs2, 一个蛋白搜索和聚类工具集，相关文章发表在NBT, NC上。GitHub地址为<https://github.com/soedinglab/MMseqs2>
```bash
wget https://github.com/soedinglab/MMseqs2/releases/download/3-be8f6/MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
tar xzf MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
mv mmseqs2 ~/opt/biosoft/
```
最后安装FastME, 这是一个基于距离的系统发育树推断软件。在<http://www.atgc-montpellier.fr/fastme/binaries.php>下载，上传到服务器
```bash
tar xf fastme-2.1.5.tar.gz
cd fastme-2.1.5
./configure --prefix=/opt/biosoft/fastme-2.1.5
make && make install
```
BLAST+可装可不装，推荐阅读[这或许是我写的最全的BLAST教程](https://www.jianshu.com/p/de28be1a3bea)
以上软件安装之后，都需要将其添加到环境变量中，才能被OrthoFinder调用。
之后在<https://github.com/davidemms/OrthoFinder/releases> 寻找最近的稳定版本下载到本地，例如[OrthoFinder v2.2.7](https://github.com/davidemms/OrthoFinder/releases/tag/v2.2.7)
```bash
tar xzf OrthoFinder-2.2.7.tar.gz
OrthoFinder-2.2.7/orthofinder -h
```
使用OrthoFinder进行基因家族分析