实用Seurat自带的热图函数`DoHeatmap`绘制的热图，感觉有点不上档次，于是我尝试使用`ComplexHeatmap`这个R包来对结果进行展示。
个人觉得好的热图有三个要素
- 聚类: 能够让别人一眼就看到模式
- 注释: 附加注释能提供更多信息
- 配色: 要符合直觉，比如说大部分都会认为红色是高表达，蓝色是低表达
在正式开始之前，我们需要先获取一下pbmc的数据，Seurat提供了R包`SeuratData`专门用于获取数据
```r
devtools::install_github('satijalab/seurat-data')
library(SeuratData)
InstallData("pbmc3k")
```
加载数据并进行数据预处理，获取绘制热图所需的数据
```r
library(SeuratData)
library(Seurat)
data("pbmc3k")
pbmc <- pbmc3k
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc,
only.pos = TRUE,
min.pct = 0.25,
logfc.threshold = 0.25)
```
先感受下Seurat自带热图
```r
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
```
下面则是介绍如何用R包`ComplexHeatmap`进行组图，虽然这个R包名带着Complex，但是并不是说这个R包很复杂，这个Complex应该翻译成复合，也就是说这个R包能在热图的基础上整合很多信息。
先安装并加载R包。
```r
BiocManager::install("ComplexHeatmap")
library(ComplexHeatmap)
```
为了手动绘制一个热图，要从Seurat对象中提取所需要的表达量矩阵。我提取的是原始的count值，然后用`log2(count + 1)`的方式进行标准化
```R
mat <- GetAssayData(pbmc, slot = "counts")
mat <- log2(mat + 1)
```
获取基因和细胞聚类信息
```r
gene_features <- top10
cluster_info <- sort(pbmc$seurat_annotations)
```
对表达量矩阵进行排序和筛选
```r
mat <- as.matrix(mat[top10$gene, names(cluster_info)])
```
用`Heatmap`绘制热图。对于单细胞这种数据，一定要设置如下4个参数
- `cluster_rows= FALSE`: 不作行聚类
- `cluster_columns= FALSE`: 不作列聚类
- `show_column_names=FALSE`: 不展示列名
- `show_row_names=FALSE`: 不展示行名，基因数目不多时候可以考虑设置为TRUE
```r
Heatmap(mat,
cluster_rows = FALSE,
cluster_columns = FALSE,
show_column_names = FALSE,
show_row_names = TRUE)
```
从图中，我们可以发现以下几个问题：
- 长宽比不合理，当然这和绘图函数无关，可以在保存时修改长宽比
- 基因名重叠，考虑调整大小，或者不展示，或者只展示重要的基因
- 颜色可以调整
- 缺少聚类信息
这些问题，我们可以通过在[ComplexHeatmap Complete Reference](https://jokergoo.github.io/ComplexHeatmap-reference/book/)查找对应信息来解决。
## 配色方案
在热图中会涉及到两类配色，一种用来表示表达量的连续性变化，一种则是展示聚类。有一个神奇的R包就是用于处理配色，他的Github地址为<https://github.com/caleblareau/BuenColors>。
```bash
devtools::install_github("caleblareau/BuenColors")
library("BuenColors")
```
它提供了一些列预设的颜色，比方说`jdb_color_maps`
```r
HSC MPP LMPP CMP CLP MEP GMP
"#00441B" "#46A040" "#00AF99" "#FFC179" "#98D9E9" "#F6313E" "#FFA300"
pDC mono GMP-A GMP-B GMP-C Ery CD4
"#C390D4" "#FF5A00" "#AFAFAF" "#7D7D7D" "#4B4B4B" "#8F1336" "#0081C9"
CD8 NK B
"#001588" "#490C65" "#BA7FD0"
```
这些颜色就能用于命名单细胞的类群，比如说我选择了前9个
```r
col <- jdb_color_maps[1:9]
names(col) <- levels(cluster_info)
```
## 增加列聚类信息
`Heatmap`的`row_split`和`column_split`参数可以通过设置分类变量对热图进行分隔。更多对热图进行拆分，可以参考[Heatmap split](https://jokergoo.github.io/ComplexHeatmap-reference/book/a-single-heatmap.html#heatmap-split)
```r
Heatmap(mat,
cluster_rows = FALSE,
cluster_columns = FALSE,
show_column_names = FALSE,
show_row_names = FALSE,
column_split = cluster_info)
```
只用文字描述可能不够好看，最好是带有颜色的分块图，其中里面的颜色和t-SNE或UMAP聚类颜色一致，才能更好的展示信息。
为了增加聚类注释，我们需要用到`HeatmapAnnotation`函数，它对细胞的列进行注释，而`rowAnnotation`函数可以对行进行注释。这两个函数能够增加各种类型的注释，包括条形图，点图，折线图，箱线图，密度图等等，这些函数的特征是`anno_xxx`，例如`anno_block`就用来绘制区块图。
```r
top_anno <- HeatmapAnnotation(
cluster = anno_block(gp = gpar(fill = col), # 设置填充色
labels = levels(cluster_info),
labels_gp = gpar(cex = 0.5, col = "white"))) # 设置字体
```
其中`anno_block`中的`gp`参数用于设置各类**图形参数**，`labels`设置标签，`labels_gp`设置和标签相关的**图形参数**。可以用`?gp`来了解有哪些**图形参数**。
```r
Heatmap(mat,
cluster_rows = FALSE,
cluster_columns = FALSE,
show_column_names = FALSE,
show_row_names = FALSE,
column_split = cluster_info,
top_annotation = top_anno, # 在热图上边增加注释
column_title = NULL ) # 不需要列标题
```
## 突出重要基因
由于基因很多直接展示出来，根本看不清，我们可以强调几个标记基因。用到两个函数是`rowAnnotation`和`anno_mark`
已知不同类群的标记基因如下
| Cluster ID | Markers | Cell Type |
| :--------- | :------------ | :----------- |
| 0 | IL7R, CCR7 | Naive CD4+ T |
| 1 | IL7R, S100A4 | Memory CD4+ |
| 2 | CD14, LYZ | CD14+ Mono |
| 3 | MS4A1 | B |
| 4 | CD8A | CD8+ T |
| 5 | FCGR3A, MS4A7 | FCGR3A+ Mono |
| 6 | GNLY, NKG7 | NK |
| 7 | FCER1A, CST3 | DC |
| 8 | PPBP | Platelet |
我们需要给`anno_mark`提供基因所在行即可。
```r
mark_gene <- c("IL7R","CCR7","IL7R","S100A4","CD14","LYZ","MS4A1","CD8A","FCGR3A","MS4A7","GNLY","NKG7","FCER1A", "CST3","PPBP")
gene_pos <- which(rownames(mat) %in% mark_gene)
row_anno <- rowAnnotation(mark_gene = anno_mark(at = gene_pos,
labels = mark_gene))
```
接着绘制热图
```r
Heatmap(mat,
cluster_rows = FALSE,
cluster_columns = FALSE,
show_column_names = FALSE,
show_row_names = FALSE,
column_split = cluster_info,
top_annotation = top_anno,
right_annotation = row_anno,
column_title = NULL)
```
关于如何增加标记注释，参考[mark-annotation](https://jokergoo.github.io/ComplexHeatmap-reference/book/heatmap-annotations.html#mark-annotation)
## 调增图例位置
目前的热图还有一个问题，也就是表示表达量范围的图例太占位置了，有两种解决方法
- 参数设置`show_heatmap_legend=FALSE`直接删掉。
- 利用`heatmap_legend_param`参数更改样式
我们根据[legends](https://jokergoo.github.io/ComplexHeatmap-reference/book/legends.html)这一节的内容进行一些调整
```r
Heatmap(mat,
cluster_rows = FALSE,
cluster_columns = FALSE,
show_column_names = FALSE,
show_row_names = FALSE,
column_split = cluster_info,
top_annotation = top_anno,
right_annotation = row_anno,
column_title = NULL,
heatmap_legend_param = list(
title = "log2(count+1)",
title_position = "leftcenter-rot"
))
```
因为ComplextHeatmap是基于Grid图形系统，因此可以先绘制热图，然后再用`grid::draw`绘制图例，从而实现将条形图的位置移动到图中的任意位置。
先获取绘制热图的对象
```r
p <- Heatmap(mat,
cluster_rows = FALSE,
cluster_columns = FALSE,
show_column_names = FALSE,
show_row_names = FALSE,
column_split = cluster_info,
top_annotation = top_anno,
right_annotation = row_anno,
column_title = NULL,
show_heatmap_legend = FALSE
)
```
根据`p@matrix_color_mapping`获取图例的颜色的设置，然后用`Legend`构建图例
```r
col_fun <- circlize::colorRamp2(c(0, 1, 2 ,3, 4),
c("#0000FFFF", "#9A70FBFF", "#D8C6F3FF", "#FFC8B9FF", "#FF7D5DFF"))
lgd <- Legend(col_fun = col_fun,
title = "log2(count+1)",
title_gp = gpar(col="white", cex = 0.75),
title_position = "leftcenter-rot",
#direction = "horizontal"
at = c(0, 1, 4),
labels = c("low", "median", "high"),
labels_gp = gpar(col="white")
)
```
绘制图形
```r
grid.newpage() #新建画布
draw(p) # 绘制热图
draw(lgd, x = unit(0.05, "npc"),
y = unit(0.05, "npc"),
just = c("left", "bottom")) # 绘制图形
```
ComplexHeatmap绘制热图非常强大的工具，大部分我想要的功能它都有，甚至我没有想到的它也有，这个教程只是展示其中一小部分功能而已，还有很多功能要慢慢探索。
「热图」ComplexHeatmap展示单细胞聚类
