## Canu简介
Canu是Celera的继任者，能用于组装PacBio和Nanopore两家公司得到的测序结果。
Canu分为三个步骤，纠错，修整和组装，每一步都差不多是如下几个步骤：
- 加载read到read数据库，gkpStore
- 对k-mer进行技术，用于计算序列间的overlap
- 计算overlap
- 加载overlap到overlap数据库，OvlStore
- 根据read和overlap完成特定分析目标
- read纠错时会从overlap中挑选一致性序列替换原始的噪声read
- read修整时会使用overlap确定read哪些区域是高质量区域，哪些区域质量较低需要修整。最后保留单个最高质量的序列块
- 序列组装时根据一致的overlap对序列进行编排(layout), 最后得到contig。
这三步可以分开运行，既可以用Canu纠错后结果作为其他组装软件的输入，也可以将其他软件的纠错结果作为Canu的输入，因此下面分别运行这三步,并介绍重要的参数。
几个全局参数：genomeSize设置预估的基因组大小，这用于让Canu估计测序深度； maxThreads设置运行的最大线程数；rawErrorRate用来设置两个未纠错read之间最大期望差异碱基数；correctedErrorRate则是设置纠错后read之间最大期望差异碱基数，这个参数需要在 **组装** 时多次调整；minReadLength表示只使用大于阈值的序列，minOverlapLength表示Overlap的最小长度。提高minReadLength可以提高运行速度，增加minOverlapLength可以降低假阳性的overlap。
## 组装实战
### 数据下载
数据来自于发表在 Nature Communication 的一篇文章 "[High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell](https://www.nature.com/articles/s41467-018-03016-2)"。 这篇文章提供了 _Arabidopsis thaliana_ KBS-Mac-74 的30X短片段文库二代测序、PacBio和Nanopore的三代测序以及Bionano测序数据, 由于拟南芥的基因组被认为是植物中的金标准，因此文章提供的数据适合非常适合用于练习。根据文章提供的项目编号"PRJEB21270", 在European Nucleotide Archive上找到下载地址。
```bash
## PacBio Sequal
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116568/bam/pb.bam
## MinION
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116595/fastq/ont.fq.gz
# Illuminia MiSeq
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116569/fastq/il_1.fq.gz
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116569/fastq/il_2.fq.gz
```
下载的PacBio数据以BAM格式存储，可以通过安装PacBio的smrtlink工具套装，使用其中的bam2fasta工具进行转换.
```bash
# build index for convert
~/opt/biosoft/smrtlink/smrtcmds/bin/pbindex pb.bam &
# convert bam to fasta
~/opt/biosoft/smrtlink/smrtcmds/bin/bam2fasta -o pb pb.bam &
```
其实`samtools fasta`也可以将bam转成fasta文件，并且不影响之后的组装。
> PacBio的smrtlink工具套装大小为1.4G，不但下载速度慢，安装也要手动确认各种我不清楚的选项, 唯一好处就是工具很全。
### 运行Canu
**第一步**：纠错。三代测序本身错误率高，使得原始数据充满了噪音。这一步就是通过序列之间的相互比较纠错得到高可信度的碱基。主要调整两个参数
- corOutCoverage: 用于控制多少数据用于纠错。比如说拟南芥是120M基因组，100X测序后得到了12G数据，如果只打算使用最长的6G数据进行纠错，那么参数就要设置为50(120m x 50)。设置一个大于测序深度的数值，例如120，表示使用所有数据。
```bash
canu -correct \
-p ath -d pb_ath \
Threads=10 gnuplotTested=true\
genomeSize=120m minReadLength=2000 minOverlapLength=500\
corOutCoverage=120 corMinCoverage=2 \
-pacbio-raw pb.fasta.gz
```
可以将上述命令保存到shell脚本中进行运行, `nohup bash run_canu.sh 2> correct.log &`.
注: 1.7版本里会没有默认没有安装gnuplot出错，因此gnuplotTested=true 可以跳过检查。
**第二步**：修整。这一步的目的是为了获取更高质量的序列，移除可疑区域（如残留的SMRTbell接头).
```bash
canu -trim \
-p ath -d pb_ath
maxThreads=20 gnuplotTested=true\
genomeSize=120m minReadLength=2000 minOverlapLength=500\
-pacbio-corrected ath/pb_ath.correctedReads.fasta.gz
```
**第三步**: 组装。在前两步获得高质量的序列后，就可以正式进行组装. 这一步主要调整的就是纠错后的序列的错误率， correctedErrorRate，它会影响utgOvlErrorRate。这一步可以尝试多个参数，因为速度比较块。
```bash
# error rate 0.035
canu -assemble \
-p ath -d ath-erate-0.035 \
maxThreads=20 gnuplotTested=true \
genomeSize=120m\
correctedErrorRate=0.035 \
-pacbio-corrected atg/pb_ath.trimmedReads.fasta.gz
# error rate 0.050
canu -assemble \
-p ath -d ath-erate-0.050 \
maxThreads=20 gnuplotTested=true \
genomeSize=120m\
correctedErrorRate=0.050 \
-pacbio-corrected atg/pb_ath.trimmedReads.fasta.gz
```
最后输出文件下的`ath.contigs.fasta`就是结果文件。
## 一些宝贵的建议
### Nanopore组装
对于Nanopore数据，使用Canu组装并不是一个非常好的选择，我曾经以一个600多M的物种100X数据进行组装，在120线程，花了整整一个多月的时间，尽管它的组装效果真的是很好。
- rawErrorRate: 从0.144 调整到 0.12 或者更低，速度会提高5到10倍
- readSamplingCoverage, readSamplingBias: 可以抽取部分数据进行纠错，而不是全部数据
- corOutCoverage=30: 默认的30X或者40X的组装效果其实不错
- `-fast`: 对于1Gb以下的物种，可以加上该参数，会明显提高速度
### 高杂合物种组装
对于高杂合物种的组装，Canu建议是用 `batOptions=-dg 3 -db 3 -dr 1 -ca 500 -cp 50`参数尽量分出两套单倍型，然后对基因组去冗余。
`batOptions`表示传递后续的参数给组装软件`bogart`, `-dg 3 -db3`降低自动确定阈值时的错误率离差(deviation)，从而更好的分开单倍型。`-dr 1 -ca 500 -cp 50`会影响错误组装的拆分，对于一个模棱两可的contig，如果至少另一条可选路径的overlap长度至少时500bp，或者说另一条可选路径时在长度上和当前最佳路径存在50%的差异，那么就将contig进行拆分。
关于杂合物种组装的讨论，参考<https://github.com/marbl/canu/issues/201#issuecomment-233750764>
### 购买SSD避免服务器IO瓶颈
如果你的服务器线程数很多，你在普通的机械硬盘上运行组装，而且你的系统还是CentOS，那么你需要调整一个参数，避免其中一步的IO严重影响服务器性能。
Canu通过两个策略进行并行，bucketizing (‘ovb’ 任务) 和 sorting (‘ovs’ 任务)。 bucketizing会从1-overlap读取输出的overlap，将他们**复制**一份作为中间文件。sorting一步将这些文件加载到内存中进行排序然后**写出**到硬盘上。 如果你的overlap输出特别多，那么该步骤将会瞬间挤爆的你的IO.
为了避免悲剧发生，请增加如下参数: `ovsMemory=16G ovbConcurrency=15 ovsConcurrency=15`， 也就是降低这两步同时投递的任务数，缓解IO压力。
### 如何用不同服务器处理同一个任务
overlap这一步时间久，如果并没有服务器集群，而是有多台服务器，可以参考如下方法进行数据并行处理（必须要安装相同的Canu版本）
假如Canu任务中的prefix参数为coc, 用scp进行数据的传递
```bash
scp -r coc.seqStore wangjw@10.10.87.132:/data1/wjw/Coc/Canu
scp -r unitigging/1-overlapper/overlap.sh wangjw@10.10.87.132:/data1/wjw/Coc/Canu
scp -r unitigging/0-mercounts/ wangjw@10.10.87.132:/data1/wjw/Coc/Canu
```
到目标服务器的canu目录下
```bash
mkdir unitigging
mkdir -p unitigging/1-overlapper
mv 0-mercounts/ unitigging/
mv overlap.sh unitigging/1-overlapper/
```
修改`overlap.sh`里的bin路径，指定当前服务器的canu路径
之后运行任务即可
```bash
cd unitigging/1-overlapper/
./overlap.sh 77 &> 77.log
```
运行完任务之后，将目前服务器`unitigging/1-overlapper/001`目录下的`000077.oc 000077.ovb 000077.stats`文件传送回原来的服务器`unitigging/1-overlapper/001`下即可。
## 参考资料
- 官方文档: <https://canu.readthedocs.io/en/latest/index.html>
三代组装软件Canu使用
