利用k-mer进行基因组调查

在组装基因组之前一定要先对要组装的物种有一个大致的了解,判断其复杂程度, 标准如下

  • 基因组大小:基因组越大,测序花的钱越多
  • 简单基因组: 杂合度低于0.5%, GC含量在35%~65%, 重复序列低于50%
  • 二倍体普通基因组: 杂合度在0.5%~1.2%中间,重复序列低于50%。或杂合度低于0.5%,重复序列低于65%
  • 高复杂基因组: 杂合度>1.2% 或 重复率大于65%

k-mers估计法

最简单的策略就是基于k-mer对基因组做一个简单的了解, 使用jellyfish统计k-mers,然后作图

jellyfish count  -m 21 -s 20G -t 20 -o 21mer_out  -C  <(zcat test_1.fq.gz) <(zcat test_2.fq.gz)
# -m k-mers的K
# -s Hash大小, 根据文件大小确定
# -t 线程
# -o 输出前缀
# -C 统计正负链
jellyfish histo -o 21mer_out.histo 21mer_out

一些注意事项:

  1. 绝对不要用--min-qual-char或其他参数,它们会将低质量的碱基替换成N
  2. 在测序时由于不知道测得到底是DNA的哪一条链,因此k-mer及其互补链其实是等价的,所以一定要用-C参数

将数据导入R语言中,进行作图

pdf("21_mer.out.pdf")
dataframe19 <- read.table("21mer_out.histo")
plot(dataframe19[1:200,], type="l")
dev.off()

k-mers作图

由于只有一个主峰,说明该物种的杂合度并不高,基本上也就是二倍体。如果图中出现多个峰,说明它可能是多倍体或者是基因组杂合度高。

基因组大小(G)估计算法为:

$$
G= K_
/ K_
$$

其中 $K_$ 为K-mer的期望测序深度, $K_$ 为K-mer的总数。 通常将K-mer深度分布曲线的峰值作为其期望深度。

基因组的杂合性和使得来自杂合片段的K-mer深度较纯合区段降低50%。如果目标基因组有一定的杂合性,会在k-mer深度分布曲线主峰位置(c)的1/2处(c/2)出现一个小峰。杂合度越高,该峰越明显。

推荐文献: Genomic DNA k-mer spectra: models and modalities

基于组装

基于K-mers可以较好的预测基因组大小,并定性的了解基因组的复杂情况,如果想更具体的了解基因组的复杂度,可以先将50X以上的段片段进行组装,然后进行分析。

组装的工具比较多,推荐用SOAPdenovo,因为速度快。

新建一个contig.config, 增加如下内容

max_rd_len=150
[LIB]
avg_ins=200
reverse_seq=0
asm_flags=3
rd_len_cutoff=100
rank=1
pair_num_cutoff=3
map_len=32
q1=read_1.fq
q2=read_2.fq

组装出参考序列

~/opt/biosoft/SOAPdenovo2/SOAPdenovo-63mer all -s contig.config -R -K 63 -p 30 -o assembly/graph

最后graph.scafSeq是拼接后的序列, 提取出大于300bp的序列.

# adjust format
bioawk -c fastx -v name=1 '{if(length($seq)>300) print ">"name "\n" $seq;name+=1}' assembly/graph.scafSeq >contig.fa

杂合度估计

将原来的序列回贴到contig上,并用samtools+bcftools进行snp calling.统计变异的碱基占总体的比例。

mkdir -p index
bwa index contig.fa -p index/contig
bwa mem -v 2 -t 10 index/contig read_1.fq read_2.fq | samtools sort -n > align.bam
samtools mpileup -f contig align.bam | bcftools call -mv -Oz -o variants.gz

一方面由于SOAPdenovo组装过程中会出错, 另一方面samtools在变异检测上也存在很高的假阳性, 所以总得先按照深度和质量过滤一批假阳性。

bcftools view -i ' DP > 30 && MQ > 30' -H variants.vcf.gz | wc -l
# 325219, 无过滤是445113

变异数目占基因组大小的比例就是杂合度。我的contig大概是200M,找到0.3M左右的变异,也就是0.0015,即0.15%.

重复序列估计

基于同源注释,用RepeatMasker寻找重复序列. 这里要注意分析的fasta的ID不能过长,也就是最好是>scaffold_1这种形式,不然会报错。

~/opt/biosoft/RepeatMsker/RepeatMasker -e ncbi -species arabidopsis -pa 10 -gff -dir ./ contig.fa
# -e ncbi
# -species 选择物种 用~/opt/biosoft/RepeatMasker/util/queryRepeatDatabase.pl -tree 了解
# -pa 并行计算
# -gff 输出gff注释
# -dir 输出路径

输出结果中主要关注如下三个

  • output.fa.masked, 将重复序列用N代替
  • output.fa.out.gff, 以gff2形式存放重复序列出现的位置
  • output.fa.tbl, 该文件记录着分类信息
==================================================
file name: anno.fasta
sequences:         62027
total length:  273135210 bp  (273135210 bp excl N/X-runs)
GC level:         36.80 %
bases masked:   79642191 bp ( 29.16 %)
==================================================

也就是说我们的物种有30%的重复序列,作为参考,拟南芥125Mb 14%重复序列, 水稻389M,36%重复

附录:软件安装

安装RepeatMasker

cd ~/src
wget http://tandem.bu.edu/trf/downloadstrf409.linux64
mv trf409.linux64 ~/opt/bin/trf
chmod a+x ~/opt/bin/trf
# RMBlast
cd ~/src
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.6.0/ncbi-blast-2.6.0+-src.tar.gz
wget http://www.repeatmasker.org/isb-2.6.0+-changes-vers2.patch.gz
tar xf ncbi-blast-2.6.0+-src
gunzip isb-2.6.0+-changes-vers2.patch.gz
cd ncbi-blast-2.6.0+-src
patch -p1 < ../isb-2.6.0+-changes-vers2.patch
cd c++
./configure --with-mt --prefix=~/opt/biosoft/rmblast --without-debug && make && make install
# RepeatMasker
cd ~/src
wget http://repeatmasker.org/RepeatMasker-open-4-0-7.tar.gz
tar xf RepeatMasker-open-4-0-7.tar.gz
mv RepeatMasker ~/opt/biosoft/
cd ~/opt/biosoft/RepeatMasker
## 解压repbase数据到Libraries下
## 配置RepatMasker
perl ./configure

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